Uwielbiam powieści kryminalne. Zwłaszcza te, w których pojawia się sekcja zwłok, zawodowy żargon i cała droga prowadzonego śledztwa. Jak na śledczego przystało, ogóły mnie nie interesują – tak oto odkryłem patomorfologię, czyli termin zrzeszający zbiór nauk o chorobach, jak m. in. biochemia, w której skład wchodzą histochemia i cytochemia. Są to prężnie rozwijające się dziedziny, a tempo ich rozwoju ciągle przyspiesza. Ponadto, policja i medycyna sądowa korzystają z metod na nich opartych. To właśnie one otworzyły mi oczy na tak wiele kwestii, dzięki czemu z jeszcze większą przyjemnością zagłębiam się w lekturę kryminałów.
Histochemia to nauka z pogranicza histologii i biochemii o metodach wybarwiania i wykrywania (poprzez reakcje barwne) substancji chemicznych zawartych w poszczególnych tkankach (histochemia) i komórkach (cytochemia) bez uszkadzania badanej struktury. Pozwala to również, w pewnym stopniu, badać procesy biochemiczne w tkankach. W odróżnieniu od barwienia histologicznego, kontrastującego struktury komórkowo-tkankowe, reakcje histochemiczne prowadzą do uwidocznienia w preparacie mikroskopowym jedynie ściśle określonej substancji lub grup chemicznych. Cechuje je zatem specyficzność (swoistość), będącą podstawową własnością metodyki histochemicznej. Dziedzinę tą wykorzystujemy do wykrywania: aminokwasów i białek, kwasów nukleinowych, węglowodanów, lipidów, enzymów oraz innych jak, np. aldehydy czy ketony.
W reakcjach histochemicznych dochodzi do oddziaływań pomiędzy substancją wykrywaną, obecną w materiale biologicznym, a związkami chemicznymi, którymi oddziałujemy na badany element. Powstały produkt musi spełniać zatem dwa warunki:
– musi być widoczny w obrazie mikroskopowym (tzn. barwny, fluoryzujący lub elektronowo gęsty),
– powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji (które prawie zawsze jest wodne), aby uniknąć dyfuzji i nie dopuścić do zatarcia pierwotnej lokalizacji.
Do oceny reakcji histochemicznych można użyć wszystkich typów mikroskopów w zależności od zastosowanej metodyki.
W celu wykrycia określonych substancji lub grup chemicznych w komórkach i tkankach, wymagane jest od nas skorzystanie z jednego spośród kilku zasadniczych typów reakcji:
– produkt powstaje po dodaniu substratu w miejscu lokalizacji danej substancji (np. reakcja z dinitrofluorobenzenem wykrywająca reszty tyrozynowe białek)
– zmiana struktury chemicznej wykrywanej substancji – zmieniony związek – wykrywany jest przez przeprowadzenie końcowej reakcji barwnej, (np. tworzenie grup aldehydowych w wielocukrach pod wpływem utlenienia i późniejsze uwidocznienie odczynnikiem Schiffa i kwasu jodowego (VII) w reakcji P.A.S.)
Bywa i tak, że złożone procedury histochemiczne są kombinacją kilku powyższych typów reakcji.
By przejść do badań, ważne jest, aby materiał biologiczny był odpowiednio przygotowany. Wybór metodyki podporządkowany jest charakterowi wykrywanej substancji oraz wymaganiom i specyficzności reakcji. Niekiedy nawet dobre zachowanie struktury materiału musi zejść na drugi plan wobec konieczności stworzenia warunków umożliwiających optymalne i swoiste uwidocznienie wykrywanych związków chemicznych.
Korzystamy zatem z utrwalaczy, które powinny jak najpełniej zachować substancje badane w materiale, i to w niezmienionej chemicznej postaci. Ich rodzaj i czas utrwalania zaleca się dobierać indywidualnie dla każdej reakcji i w podanej, wg. przepisu, metodzie. Najczęściej stosowane utrwalacze to: dla białek – formaldehyd, cukrów – alkohol absolutny, lipidów – tlenek osmu (VIII), amin biogennych – formaldehyd i dla enzymów – aceton.
Dla niektórych substancji zalecane są również takie substancje jak, np. kwas pikrynowy/etanol/kwas octowy dla glikogenu i glikozoaminoglikanów, czy utrwalacz Carnoya dla kwasów nukleinowych.
Protaminy, histony, albuminy, globuliny, chromoproteiny, metaloproteiny – to przykłady typów białek. Pełnią nieocenioną rolę w życiu człowieka: transportują tlen (hemoglobina), pozwalają na ruch i skurcze mięśni (aktyna, miozyna), chronią organizm (immunoglobuliny) itd. Większość histochemicznych metod wykrywania białek opiera się na reakcjach barwnych z resztami określonych aminokwasów. Należą tu m.in.:
Wymienione powyżej metody są obecnie rzadko wykorzystywane z uwagi na możliwość stosowania bardziej swoistych metod immunohistochemicznych, opierających się na wykorzystaniu antygenów i przeciwciał.
Cukier biały, inaczej sacharoza, to polisacharyd na co dzień spotykany w każdym gospodarstwie domowym. Wszelkie sacharydy pełnią rolę energetyczną w ludzkim organizmie, lecz ich nadmierne spożycie skutkuje przybieraniu na wadze. Warto więc mieć to na uwadze. Wykrywanie cukrów za pomocą reakcji P.A.S jest jedną z najpopularniejszych i najszerszej stosowanych metod. Pozwala wykryć obojętne wielocukrowce zawierające pierścienie heksozowe. Pierwszy etap reakcji polega na utlenieniu materiału w 1% kwasie jodowym (VII), które prowadzi do przekształcenia grup glikolowych w grupy aldehydowe. Następnie grupy te uwidacznia się za pomocą odczynnika Schiffa, czyli odbarwionej formy fuksyny zasadowej.
Od lewej: mięsak Ewigna wykryty w reakcji P.A.S. i fuksyna zasadowa
Ciekawym faktem jest, że wykryciu ulegają również niektóre fosfolipidy nienasycone, jak np. kardiolipina czy ceroid, u których podobnie jak w cukrach, w wyniku utleniania kwasem jodowym (VII) powstanie cząsteczka grupy aldehydowej.
Tłuszcze, czy też lipidy, są niezbędne do przyswajania witamin z grupy A,D,E i K. Pełnią również funkcję izolatora, czy tkanki zapasowej dla organizmu. Do histochemicznego wykrywania lipidów używa się głównie barwników wykazujących niską rozpuszczalność w wodzie i alkoholu, natomiast wysoką w tłuszczach (Sudan III, Sudan IV, czerń sudanowa, czerwień oleista). Po zanurzeniu skrawka tkanki zawierającej skupiska lipidów do wodnego lub alkoholowego roztworu jednego z tych barwników, następuje zgodne ze stopniem rozpuszczalności przejście barwnika z fazy rozpuszczalnika do fazy lipidowej. Metoda ta opiera się zatem raczej na procesie fizycznym, niż – jak większość metod histochemicznych – na reakcji chemicznej:
Sudan III, IV i czerwień oleistą barwią tłuszcze na czerwono, a czerń sudanowa na czarno.
Od lewej: Sudan III i porównanie barwienia czernią sudanowa z czerwienią oleistą
Istnieje kilka ściśle histochemicznych metod służących do różnicowania poszczególnych klas lipidów. Należą tu m.in.:
– Reakcja z kwasem fosforomolibdenowym (wykrywa lipidy bogate w cholinę),
– Reakcja z difenylokarbozonem i rtęcią (wykrywa lecytyny i sfingomieliny); czego przykładem może być fosfolipid występująca we krwi czy błonie komórkowej – fosfatydylocholina
– Reakcja bromkowo – srebrowa (wykrywa lipidy nienasycone),
– Reakcja z ftalocyjanianem miedzi (wykrywa fosfolipidy),
Ftalocyjanian miedzi (II)
Aminy pełnią ważną rolę w funkcjonowaniu człowieka. W ich skład wchodzą m.in. adrenalina, noradrenalina, serotonina czy dopamina, znane również jako neuroprzekaźniki, lub związki o charakterze hormonalnym. Brak, podwyższona zawartość lub zaburzenie harmonii wydzielania któregoś z powyższych może prowadzić do choroby, jak np. u schizofreników dochodzi do nierównych aktywności dopaminergicznych (skutkujący omamami i urojeniami). Innym dobrym przykładem jest choroba Parkinsona lub Alzheimera (niedobór acetylocholiny doprowadza do problemów z pamięcią). Metodą wykrywania ich na poziomie mikroskopu optycznego jest liofilizacja tkanki, a następnie inkubacja liofilizowanego materiału w parach formaldehydu w podwyższonej temperaturze (ok. 80°C). Etap ten łączy w sobie proces utrwalania i reakcji histochemicznej: pary formaldehydu łatwo penetrują liofilizowaną tkankę utrwalając ją, a równocześnie formaldehyd swoiście reaguje z obecnymi w tkance aminami biogennymi, przekształcając je w intensywnie fluoryzujące pochodne. Po zatopieniu (zazwyczaj w parafinie) i pokrojeniu, wyniki reakcji ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ta określana jest skrótem FIF (fluorescencja indukowana formaldehydem).
Badania nad nimi dają znaczne możliwości; umożliwiają poznanie wieku, płci, koloru oczu, włosów danej osoby. W 50% ludzkie DNA jest podobne do DNA banana. Kwasy nukleinowe znajdziemy w większości komórek i tkanek naszego ciała. Istnieją trzy podstawowe metody ich wykrywania: Feulgena, Bracheta i fluorescencyjna.
Pierwsza z wymienionych to dwuetapowa reakcja służąca do wykrywania DNA. W pierwszym etapie tkankę poddaje się ściśle kontrolowanej hydrolizie w 1N kwasie solnym. Efektem tej hydrolizy jest pęknięcie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie przy II węglu grupy aldehydowej. Powstałe w DNA grupy aldehydowe wykrywa się następnie odczynnikiem Schiffa (ryc. 6.4). Hydroliza nie powoduje analogicznych zmian w cząsteczkach rybozy, stąd reakcja nie uwidacznia RNA.
Od lewej: Odczynnik Schiffa i odczynnik Schiffa z aldehydem
Metoda Bracheta służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale, za pomocą tzw. polichromu Unny, czyli mieszaniny zieleni metylowej i pyroniny. Zieleń metylowa wykazuje stereospecyficzne powinowactwo do DNA (tzn. kształt przestrzenny cząsteczki zieleni metylowej pasuje do kształtu fragmentu DNA), natomiast pyronina swoiście wiąże się z RNA. Efektem procedury jest zatem czerwone zabarwienie rejonów komórki bogatych w RNA (jąderko, obszary chromatyny obfitujące w rybosomy) i zielono-fioletowy odcień chromatyny jądrowej (wynikający z nałożenia się barw DNA i RNA). Metoda Bracheta zakłada każdorazową kontrolę barwienia przez wytrawienie części skrawków rybonukleazą. Powoduje to zniknięcie czerwonych (pyroninochłonnych) struktur i zachowanie tylko zabarwionej na zielono chromatyny.
Barwienie metodą Bracheta
Klasyczne metody histochemiczne umożliwiają jedynie ogólne wykrywanie kwasów nukleinowych. Identyfikację ich odcinków charakteryzujących się ściśle określoną sekwencją nukleotydów zapewnia znacznie bardziej swoista hybrydocytochemia.
Ostatnia to metoda fluorescencyjna, która w ostatnich latach zyskała dużą popularność z racji na swoistość wiązania się z DNA (DAPI – diaminofenyloindol, Hoechst 33258, Hoechst 33342, jodek propidyny, bromek etydyny). Stosuje się je przede wszystkim do podbarwiania jąder komórkowych lub chromosomów w metodach immunofluorescencyjnych i hybrydocytochemicznych.
Od lewej: Jądro komórkowe, jądro limfocytu (zielone, metodą in situ) i kariotyp żeński wybarwione poprzez DAPI
Powyższy artykuł to jedynie czubek góry lodowej, na który chciałbym się wspiąć. Ta niezwykle dynamicznie rozwijająca się dziedzina daje duże możliwości stawiania przed sobą wyzwań intelektualnych, a także znalezienie ciekawej, dobrze płatnej pracy.
